AAT Bioquest1315 Buccutite™ Rapid Protein Crosslinking Kit *Microscale Optimized for Crosslinking 100 ug Antibody Per Reaction* 

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美國(guó)AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家為從事生命科學(xué)研究、診斷研發(fā)及藥物開(kāi)發(fā)的科學(xué)家研發(fā)、生產(chǎn)和銷售生物分析研究試劑和試劑盒的公司。公司致力于光譜學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，包括吸收（顏色），熒光和發(fā)光技術(shù)。AAT Bioquest的產(chǎn)品幫助quan世界的科學(xué)家和生物醫(yī)藥研究者更好的了解生物化學(xué)，免疫學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域。AAT Bioquest會(huì)不斷介紹新產(chǎn)品，快速的豐富各個(gè)領(lǐng)域的產(chǎn)品。

 AAT Buccuite™快速蛋白質(zhì)交聯(lián)試劑盒

AAT Bioquest1315 Buccutite™ Rapid Protein Crosslinking Kit *Microscale Optimized for Crosslinking 100 ug Antibody Per Reaction*，產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

產(chǎn)品品牌：AAT Bioquest

產(chǎn)品貨號(hào)：1315

產(chǎn)品名稱：Buccuite™快速蛋白質(zhì)交聯(lián)試劑盒

英文名稱：Buccutite™ Rapid Protein Crosslinking Kit *Microscale Optimized for Crosslinking 100 ug Antibody Per Reaction*

產(chǎn)品規(guī)格：2 Labelings

產(chǎn)品說(shuō)明：

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)偶聯(lián)通常使用雙功能接頭（如 SMCC）進(jìn)行。SMCC的一端（通過(guò)NHS酯）與氨基酸賴氨酸和N-末端中的胺（-NH2）反應(yīng)，另一端（通過(guò)馬來(lái)酰亞胺）與氨基酸半胱an酸中的硫醇基團(tuán)（-SH）反應(yīng)。然而，SMCC修飾的蛋白質(zhì)極不穩(wěn)定且經(jīng)常自反應(yīng)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)通常含有胺和硫醇基團(tuán)，導(dǎo)致大量的同源交聯(lián)。此外，量化蛋白質(zhì)上馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的數(shù)量是相當(dāng)困難和乏味的。亞洲空運(yùn)中心生物探索開(kāi)發(fā)了一種方便有效的交聯(lián)方法，以高偶聯(lián)率連接兩種生物分子。我們的方法使用一對(duì)交聯(lián)劑：Buccutite MTA和Buccutite™™ FOL.MTA被添加到一種蛋白質(zhì)中，而FOL被添加到另一種蛋白質(zhì)中。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)是通過(guò)混合蛋白質(zhì)-1-頰鐵礦MTA和蛋白質(zhì)-2-頰銅礦™ ™ FOL引發(fā)的。這種交聯(lián)反應(yīng)在極其溫和的中性條件下發(fā)生，無(wú)需任何催化劑，并且穩(wěn)定而高效。

組件

組件 A：鈍石™ MTA 2 瓶（凍干）

組分 B：鈍化石™ FOL 2 瓶（凍干）

組分C：反應(yīng)緩沖液 1 瓶 （50 μL）

組件D：離心柱 4 列

示例協(xié)議

一目了然

協(xié)議摘要

1. 準(zhǔn)備蛋白質(zhì)溶液

2. 運(yùn)行蛋白-1 頰鐵礦™ MTA 反應(yīng)

3. 運(yùn)行蛋白-2 頰鐵礦™ FOL 反應(yīng)

4. 通過(guò)在室溫下混合和孵育來(lái)交聯(lián)蛋白-1和蛋白-2反應(yīng)

重要

收到后，將組件A和B儲(chǔ)存在-20°C。 如果儲(chǔ)存得當(dāng)，試劑盒應(yīng)穩(wěn)定保存六個(gè)月。不要冷凍反應(yīng)緩沖液（組分C）和離心柱（組分D）。加熱所有組件并在打開(kāi)小瓶之前短暫離心。在開(kāi)始偶聯(lián)之前，請(qǐng)立即準(zhǔn)備必要的溶液。以下SOP是將100μg蛋白質(zhì)-1與蛋白質(zhì)2偶聯(lián)的示例。

注意： 實(shí)現(xiàn)最佳性能的關(guān)鍵參數(shù)：

1. 蛋白質(zhì)分子量：>100，000道爾頓

2. 蛋白質(zhì)濃度：>= 1毫克/毫升

3. 蛋白質(zhì)樣品體積：60~120 μL

工作溶液的制備

蛋白質(zhì)工作溶液

為了標(biāo)記 100 μg 蛋白質(zhì)-1 和蛋白質(zhì)-2（假設(shè)兩種蛋白質(zhì)的濃度為 1 mg/mL），請(qǐng)將 5 μL（占總反應(yīng)體積的 5%）反應(yīng)緩沖液（組分 C）與 100 μL 每種蛋白質(zhì)溶液混合。

注意： 蛋白質(zhì)應(yīng)溶解在1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，pH 7.2-7.4。如果將其溶解在甘an酸緩沖液中，則必須用1X PBS，pH 7.2-7.4進(jìn)行透析，或使用ReadiUse™ 10KD旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器（AAT Bioquest的貨號(hào)60502）去除廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（如**銨和醋酸銨）。

實(shí)驗(yàn)方案樣本

運(yùn)行蛋白 1-頰鐵礦™ MTA 反應(yīng)

1. 將 105 μL 蛋白質(zhì)-1 溶液直接加入 Buccutite ™ MTA（組分 A）小瓶中，并通過(guò)反復(fù)移液幾次或渦旋小瓶幾秒鐘來(lái)充分混合。

2. 將蛋白質(zhì)-1-頰鐵礦™ MTA反應(yīng)混合物在室溫下保持30-60分鐘。如果需要，蛋白質(zhì)-頰鐵礦™ MTA反應(yīng)混合物可以旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)更長(zhǎng)的時(shí)間。

3. 通過(guò)脫鹽柱純化蛋白質(zhì)-1-頰鐵礦™ MTA。有關(guān)詳細(xì)操作，請(qǐng)參閱“制備用于蛋白質(zhì)純化的離心柱"部分。

4. 計(jì)算脫鹽后產(chǎn)率為1%的蛋白質(zhì)-75-頰鐵礦™ MTA的濃度。（例如：如果從100μg蛋白質(zhì)開(kāi)始，脫鹽柱純化后，回收蛋白量為~75μg。

運(yùn)行蛋白 2-頰鐵礦™ FOL 反應(yīng)

1. 將 105 μL Protein-2 溶液直接加入 Buccutite ™ FOL 小瓶（組分 B）中，并通過(guò)重復(fù)移液幾次或渦旋小瓶幾秒鐘來(lái)充分混合。

2. 將蛋白質(zhì)-2-頰鐵礦™ FOL反應(yīng)混合物在室溫下保持30-60分鐘。如果需要，蛋白質(zhì)-頰鐵礦™ FOL反應(yīng)混合物可以旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)更長(zhǎng)的時(shí)間。

3. 通過(guò)脫鹽柱純化蛋白質(zhì)-2-頰鐵礦™ FOL。有關(guān)詳細(xì)操作，請(qǐng)參閱“制備用于蛋白質(zhì)純化的離心柱"部分。

4. 計(jì)算脫鹽后產(chǎn)率為2%的蛋白質(zhì)-75-頰鐵礦™ FOL的濃度。

交聯(lián)蛋白-1和蛋白-2反應(yīng)

1. 交聯(lián)反應(yīng)是通過(guò)以所需的摩爾比混合蛋白質(zhì)-1-頰鐵礦MTA和蛋白質(zhì)-2-頰鐵礦™ ™ FOL引發(fā)的。通常，頰鐵礦 FOL 修飾的蛋白質(zhì)-2 與頰鐵礦 ™ ™ MTA 修飾的蛋白質(zhì)-1 以 1.5-2.0 摩爾比混合，以驅(qū)動(dòng)交聯(lián)反應(yīng)完成?；旌媳壤梢愿鶕?jù)您的下游應(yīng)用和蛋白質(zhì)成本進(jìn)行反轉(zhuǎn)。

2. 將混合物在室溫下旋轉(zhuǎn)1~2小時(shí)或在4°C下放置過(guò)夜。反應(yīng)混合物現(xiàn)在準(zhǔn)備使用，或儲(chǔ)存在4°C。 脫鹽是可選的。

可選：偶聯(lián)物分析和純化

1. 可以在SDS運(yùn)行緩沖液系統(tǒng)中使用2-4%Bis-Tis蛋白凝膠分析少量反應(yīng)混合物（例如：4~12 mg），以檢查偶聯(lián)結(jié)果。

2. 偶聯(lián)反應(yīng)混合物含有所需的偶聯(lián)物以及少量未連接的蛋白質(zhì)-2（過(guò)量使用）。如果需要，可以通過(guò)體積排阻色譜（SEC）純化反應(yīng)混合物，并將所需的偶聯(lián)物級(jí)分合并并合并。

準(zhǔn)備用于純化的離心柱

1. 將提供的離心柱（組分D）倒置數(shù)次，以重新懸浮沉降的凝膠并去除任何氣泡。

2. 折斷吸頭并將色譜柱放入洗滌管中（2 mL，未提供）。取下蓋子，讓多余的堆積緩沖液通過(guò)重力排出到凝膠床的頂部。如果色譜柱沒(méi)有開(kāi)始流動(dòng)，請(qǐng)將蓋子推回色譜柱中，然后再次將其取下以開(kāi)始流動(dòng)。丟棄排出的緩沖液，然后將色譜柱放回洗滌管中。但是，如果將色譜柱放入12 x 75 mm試管（未提供）中，請(qǐng)立即離心。

3. 在2，1 x g 的擺動(dòng)桶離心機(jī)中離心000分鐘（參見(jiàn)離心說(shuō)明部分）以除去保壓緩沖液。丟棄緩沖區(qū)。

4. 將 1-2 mL 1X PBS （pH 7.2-7.4） 涂于色譜柱上。每次施用PBS后，讓緩沖液通過(guò)重力排出，或?qū)⑸V柱離心2分鐘以除去緩沖液。丟棄收集管中的緩沖液。重復(fù)此過(guò)程 3-4 次。

5. 在2，1 x g 的擺動(dòng)桶離心機(jī)中離心000分鐘（參見(jiàn)離心說(shuō)明部分）以除去保壓緩沖液。丟棄緩沖區(qū)。

6. 將色譜柱放入干凈的收集管（1.5 mL，未提供）。小心地將樣品（~105 μL）直接加載到色譜柱的中心。

7. 上樣后，加入 10 μL 1X PBS （pH 7.2-7.4），以 5，6 x g 離心柱 1-000 分鐘，并收集含有所需蛋白質(zhì)-1-頰鐵礦 MTA 溶液或蛋白質(zhì)-2-頰鐵礦™ ™ FOL 溶液的溶液。

離心注意事項(xiàng)

離心柱（組分 D）可裝入 2 mL 微量離心管或 12 x 75 mm 試管中，以便在離心過(guò)程中收集樣品。將2 mL微量管與色譜柱配合使用，進(jìn)行初始色譜柱平衡步驟。

能夠產(chǎn)生最小力為 1，000 x g 的擺動(dòng)式斗式離心機(jī)適用于 Bio-Spin 色譜柱。在特定轉(zhuǎn)速下產(chǎn)生的引力是微量離心機(jī)轉(zhuǎn)子半徑的函數(shù)。有關(guān)從每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （RPM） 轉(zhuǎn)換為離心力或重力的信息，請(qǐng)參閱水平吊籃離心機(jī)使用手冊(cè)?；蛘撸褂靡韵鹿接?jì)算達(dá)到 1，000 x g 重力所需的速度（以 RPM 為單位）：

區(qū)域合作框架 （x g） = （1.12 x 10^-5）×（轉(zhuǎn)/分）×2×r

RCF是相對(duì)離心力

r 是從轉(zhuǎn)子中心到 Bio-Spin 柱中間測(cè)量的半徑（以厘米為單位）

RPM 是轉(zhuǎn)子的速度

 AAT Buccuite™快速蛋白質(zhì)交聯(lián)試劑盒

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