AAT Bioquest  12604  Amplite® Colorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit 200 Tests 

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美國(guó)AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家為從事生命科學(xué)研究、診斷研發(fā)及藥物開發(fā)的科學(xué)家研發(fā)、生產(chǎn)和銷售生物分析研究試劑和試劑盒的公司。公司致力于光譜學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，包括吸收（顏色），熒光和發(fā)光技術(shù)。AAT Bioquest的產(chǎn)品幫助quan世界的科學(xué)家和生物醫(yī)藥研究者更好的了解生物化學(xué)，免疫學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域。AAT Bioquest會(huì)不斷介紹新產(chǎn)品，快速的豐富各個(gè)領(lǐng)域的產(chǎn)品。

 AAT Bioquest 比色β-半乳糖苷酶測(cè)定試劑盒

AAT Bioquest 12604 Amplite® Colorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit 200 Tests，產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

產(chǎn)品品牌：AAT Bioquest

產(chǎn)品貨號(hào)：12604

產(chǎn)品名稱：Amplite®比色β-半乳糖苷酶測(cè)定試劑盒

英文名稱：Amplite® Colorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit

產(chǎn)品規(guī)格：200 Tests

產(chǎn)品說明：

大腸桿菌β-半乳糖苷酶是一種464 kD四聚體。β-半乳糖苷酶的每個(gè)單位由五個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中第三個(gè)是活性位點(diǎn)。它是細(xì)胞中必需的酶。這種酶的缺乏可導(dǎo)致半乳唾液酸病或Morquio B綜合征。在大腸桿菌中，β-半乳糖苷酶由LacZ操縱子的活化產(chǎn)生。LacZ表達(dá)的檢測(cè)已成為常規(guī)，每個(gè)細(xì)胞只需檢測(cè)5個(gè)拷貝的β-半乳糖苷酶。該試劑盒使用顯色半乳糖苷酶底物，可以靈敏地區(qū)分 LacZ+ 和 LacZ- 細(xì)胞。淺黃色底物與半乳糖苷酶反應(yīng)時(shí)生成強(qiáng)紫色產(chǎn)物。它既可用于檢測(cè) ELISA 型測(cè)定系統(tǒng)中的半乳糖苷酶偶聯(lián)物，也可用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞中的 LacZ 基因表達(dá)。Amplite® 比色 β-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒隨附所有基本成分和優(yōu)化的檢測(cè)方案。它可用于篩選半乳糖苷酶抑制劑或誘導(dǎo)劑。

平臺(tái)

吸光度酶標(biāo)儀

吸光度 580/460 納米

推薦板 清除底部

組件

組分A：Resorufinβ-D-半乳糖苷 1瓶

組分B：反應(yīng)緩沖液 1 瓶 （20 mL）

組件 C：停止緩沖區(qū) 1 瓶 （10 mL）

組分D：裂解緩沖液 1 瓶 （10 mL）

構(gòu)成部分E：DMSO 1 瓶 （100 μL）

組分F：β-巰基乙* 1 瓶 （100 μL）

示例協(xié)議

一目了然

協(xié)議摘要

1. 用LacZ基因制備穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞

2. 用測(cè)試化合物孵育細(xì)胞（樣品）

3. 裂解細(xì)胞

4. 將裂解物轉(zhuǎn)移到微量滴定板上

5. Add FDG working solution

6. 根據(jù)細(xì)胞類型在室溫或 37°C 下孵育至少 5 分鐘

7. 添加停止解決方案

8. 測(cè)量 580 nm 至 460 nm 波長(zhǎng)處的 OD 比（Ab580/血型460)

重要注意事項(xiàng)

使用前將所有套件組件解凍至室溫。

儲(chǔ)備液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

1. Resorufinβ-D-半乳糖苷酶儲(chǔ)備溶液（200X）：

將50μLDMSO（組分E）加入到β-D-半乳糖苷酶（組分A）的小瓶中，制成200X間苯鹵靈β-D-半乳糖苷酶儲(chǔ)備溶液。注意：25 μL 該儲(chǔ)備溶液足以用于一個(gè) 96 孔板。避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品

可選（如果需要標(biāo)準(zhǔn)曲線）：用0.3%β-巰基乙*測(cè)定緩沖液制備β-半乳糖苷酶（大腸桿菌）標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)稀釋液。將標(biāo)準(zhǔn)曲線上每個(gè)點(diǎn)的 50 μL 等分試樣轉(zhuǎn)移到板的對(duì)照孔中。β-半乳糖苷酶的最高推薦量為 200 mU/mL （200 - 400 ng）。建議對(duì)由 1 個(gè)點(diǎn)組成的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行 3：8 連續(xù)稀釋。注意：調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線以適應(yīng)特定的實(shí)驗(yàn)條件，例如細(xì)胞類型、數(shù)量、轉(zhuǎn)染效率和培養(yǎng)板的大小。每次進(jìn)行測(cè)定時(shí)，必須新鮮制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋液。

工作溶液的制備

1. 0.3 % β-巰基乙*測(cè)定緩沖液：

將 30 μL β-巰基乙*（組分 F）加入 10 mL 反應(yīng)緩沖液（組分 B）中，并充分混合。注意：制備酶稀釋緩沖液需要額外的緩沖液，用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. ResorufinβDG工作溶液：

將25 μLResorufinβ-D-半乳糖苷酶儲(chǔ)備溶液（200X）加入5 mL 0.3%β-巰基乙*測(cè)定緩沖液中。注意：該工作解決方案足以用于一個(gè) 96 孔板。

3. 裂解緩沖液工作溶液：

使用前將 5 μL β-巰基乙*（組分 F）加入 5 mL 裂解緩沖液（組分 D）中。注意：在裂解細(xì)胞之前，始終將0.1%β-巰基乙*加入裂解緩沖液中

實(shí)驗(yàn)方案樣本

表 1.推薦的細(xì)胞培養(yǎng)板裂解緩沖液工作溶液體積。

培養(yǎng)板類型 裂解緩沖液工作溶液（μL/孔）

96孔板 50

24孔板 250

12孔板 500

6孔板 1000

60 mm 板 2000

100 mm 板 4000

制備哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞提取物

1. 用測(cè)試化合物處理含有LacZ基因的細(xì)胞一段時(shí)間。

2. 用1X PBS洗滌細(xì)胞兩次。不要移開細(xì)胞。

3. 用裂解緩沖液工作溶液相應(yīng)地裂解細(xì)胞。

對(duì)于貼壁細(xì)胞：將裂解緩沖液工作溶液添加到培養(yǎng)板中。有關(guān)建議的卷，請(qǐng)參見表 1。

對(duì)于非貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞沉淀到離心管中，并向管中加入 50 - 2000 μL（取決于細(xì)胞沉淀的大小）裂解緩沖液工作溶液。

4. 將上一步的細(xì)胞在室溫下孵育10-15分鐘，并輕輕旋轉(zhuǎn)板或試管數(shù)次以確保wan全裂解。

5. 進(jìn)行β-半乳糖苷酶測(cè)定或?qū)悠防鋬鲈?80°C直至使用。注意：良好的裂解也可以通過快速凍融循環(huán)獲得（在-1°C至-2°C下冷凍20-80小時(shí)，在室溫下解凍）。或者，將細(xì)胞裂解液離心2-3分鐘以沉淀不溶性物質(zhì)，然后測(cè)定上清液。

運(yùn)行 β-半乳糖苷酶測(cè)定

1. 如果需要，在室溫下解凍裂解細(xì)胞的管或板。如果將細(xì)胞接種在96孔板中，則直接在96孔板上進(jìn)行測(cè)定。

2. 將 50 μL 細(xì)胞提取物加入 96 孔板的每個(gè)孔中。如果需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，請(qǐng)為標(biāo)準(zhǔn)曲線（50 uL/孔）保存一些對(duì)照孔。注意：如有必要，當(dāng)轉(zhuǎn)染效率非常高時(shí)，將裂解液稀釋在裂解緩沖液工作溶液中，或在轉(zhuǎn)染效率低時(shí)減少裂解緩沖液的體積。如果在96孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，或者將穩(wěn)定的細(xì)胞系接種到96孔板中，則直接在板上進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于內(nèi)源性β-半乳糖苷酶活性控制，從未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中加入 50 μL 細(xì)胞裂解物。對(duì)于空白對(duì)照，加入 50 μL 裂解緩沖液工作溶液。

3. 向每個(gè)孔中加入 50 μL ResorufinβDG 工作溶液。根據(jù)細(xì)胞類型，將板在室溫或 37°C 下孵育約 10 分鐘至 4 小時(shí)。

4. 向每個(gè)孔中加入 50 μL 終止緩沖液（組分 C）。

5. 通過測(cè)量580nm至460nm波長(zhǎng)處的OD比（Ab580/血型460）使用吸光度酶標(biāo)儀。

  AAT Bioquest 比色β-半乳糖苷酶測(cè)定試劑盒

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